Genomske sekvence večine virusov so znane.Sonde nukleinske kisline, ki so kratki segmenti DNA, zasnovani za hibridizacijo s komplementarnimi virusnimi segmenti DNA ali RNA.Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je učinkovitejša tehnika za odkrivanje virusov.Nedavno so bile razvite visoko zmogljive diagnostične metode.
A. Tehnika hibridizacije nukleinskih kislin
Hibridizacija nukleinske kisline, ki v glavnem vključuje Southern blotting (Southern) in Northern blotting (Northern), je hitro razvijajoča se nova tehnika na področju diagnostike virusov.Utemeljitev hibridizacijskega testa je uporaba kratkih segmentov DNA (imenovanih "sonda"), zasnovanih za hibridizacijo s komplementarnimi segmenti virusne DNA ali RNA.S segrevanjem ali alkalno obdelavo se dvoverižna ciljna DNA ali RNA loči na enojne verige in se nato imobilizira na trdnem nosilcu.Po tem se doda sonda in hibridizira s ciljno DNA ali RNA.Ker je sonda označena z izotopom ali neradioaktivnim nuklidom, je mogoče ciljno DNK ali RNK zaznati z avtoradiografijo ali s sistemom biotin-avidin.Ker je bila večina virusnih genomov kloniranih in sekvenciranih, jih je mogoče odkriti z uporabo virusno specifičnih sekvenc kot sond v vzorcu.Trenutno metode hibridizacije vključujejo: dot blot, in situ hibridizacijo v celicah, DNA blotting (DNA) (Southern blot) in RNA blotting (RNA) (Northern blot).
Tehnologija B.PCR
V zadnjih letih je bila razvita vrsta in vitro tehnik pomnoževanja nukleinske kisline, ki temeljijo na PCR, za testiranje neobčutljivih virusov ali virusov, ki jih ni mogoče gojiti.PCR je metoda, ki lahko sintetizira specifično zaporedje DNA z reakcijo polimeraze in vitro.Postopek PCR vključuje toplotni cikel treh korakov: denaturacija, žarjenje in podaljšanje. Pri visoki temperaturi (93 ℃ ~ 95 ℃) se dvoverižna DNA loči na dve enojni verigi DNA;nato se pri nizki temperaturi (37 ℃ ~ 60 ℃) dva sintetizirana nukleotidna primerja prižgeta na komplementarne segmente DNA;medtem ko se pri ustrezni temperaturi za encim Taq (72 ℃) začne sinteza novih verig DNA od 3' konca začetnika z uporabo komplementarne DNA kot predloge in posameznih nukleotidov kot materiala.Tako se lahko po vsakem ciklu ena veriga DNK pomnoži v dve verigi.S ponavljanjem tega postopka se lahko vsaka veriga DNK, sintetizirana v enem ciklu, uporabi kot predloga v naslednjem ciklu, število verig DNK pa se v vsakem ciklu podvoji, kar pomeni, da se proizvodnja PCR pomnoži s hitrostjo 2n log.Po 25 do 30 ciklih je proizvodnja PCR identificirana z elektroforezo, specifične produkte DNA pa je mogoče opazovati pod UV svetlobo (254 nm).Zaradi prednosti specifičnosti, občutljivosti in priročnosti je bil PCR sprejet v klinični diagnostiki številnih virusnih okužb, kot so HCV, HIV, CMV in HPV.Ker je PCR zelo občutljiv, lahko zazna DNK virusa na ravni fg, je treba operacijo izvesti zelo previdno, da se izognete lažno pozitivnim rezultatom.Poleg tega pozitiven rezultat testa nukleinske kisline ne pomeni, da je v vzorcu živ nalezljiv virus.
S široko uporabo tehnike PCR se razvijajo nove tehnike in metode, ki temeljijo na tehniki PCR za različne namene testiranja.Na primer, kvantitativna PCR v realnem času lahko zazna virusno obremenitev;in situ PCR se uporablja za identifikacijo virusne okužbe v tkivu ali celicah;Ugnezdeni PCR lahko poveča specifičnost PCR.Med njimi se je hitreje razvila kvantitativna PCR v realnem času.Številne nove tehnike, kot so hidrolizna sonda TaqMan, hibridizacijska sonda in sonda molekularnega svetilnika, so bile združene v tehniko kvantitativne PCR v realnem času, ki se pogosto uporablja v kliničnih raziskavah.Poleg natančne identifikacije virusne obremenitve v telesnih tekočinah pacientov se ta metoda lahko uporablja tudi za odkrivanje mutanta, tolerantnega na zdravila.Zato se kvantitativna PCR v realnem času uporablja predvsem pri vrednotenju zdravilnega učinka in nadzoru tolerance zdravil.
C. Visoko zmogljiva detekcija virusnih nukleinskih kislin
Da bi zadostili potrebam po hitrem diagnosticiranju novih pojavnih nalezljivih bolezni, so bile vzpostavljene različne visoko zmogljive metode odkrivanja, kot so DNK čipi (DNK).Za čipe DNK se sintetizirajo specifične sonde in pritrdijo na majhne silicijeve čipe v zelo visoki gostoti, da tvorijo mikromrežo sonde DNK (DNK), ki jo je mogoče hibridizirati z vzorcem.Signal hibridizacije je mogoče prikazati s konfokalnim mikroskopom ali laserskim skenerjem in ga računalniško nadalje obdelati ter pridobiti ogromen nabor podatkov o različnih genih.Obstajata dve vrsti DNK čipov."Sintezni čip" je naslednji: specifični oligonukleotidi se sintetizirajo neposredno na čipih.Drugi je čip za zbiranje DNK.Klonirani geni ali produkti PCR so urejeno natisnjeni na stekelcu.Prednost tehnologije DNK čipov je hkratna detekcija ogromne količine zaporedij DNK.Najnovejša različica čipa za odkrivanje patogenov lahko identificira več kot 1700 človeških virusov hkrati.Tehnologija čipov DNK je rešila težave tradicionalnih metod hibridizacije nukleinskih kislin in ima zelo široko uporabo pri diagnozi virusov in epidemioloških študijah.
Čas objave: 23. december 2020